污水处理厂活性污泥中四环素耐药基因和耐四环素乳糖发酵型肠杆菌研究

【摘要】： 抗生素在人类以及畜禽业中的滥用导致了环境中耐药细菌大范围的传播。因此,为了避免对公共健康产生影响,本研究利用现代分子生物学技术结合细菌传统分离培养等方法,分析污水厂水样中耐四环素乳糖发酵型肠杆菌(TR-LFE)的多样性,并针对污水厂活性污泥以及自然湖体中的四环素耐药基因做基因检测及量化,以了解本地区污水厂中耐药菌所占的比例、活性污泥中四环素耐药基因的分布情况以及一般地表径流中所含有耐药基因的种类和数量。 研究结果显示,从污水厂所提取的水样进行选择性培养后看到,在含抗生素平板上,乳糖发酵型肠杆菌(LFE)中绝大多数是耐四环素乳糖发酵型肠杆菌(TR-LFE),占居平板的70%～90%。但是经一系列检测后表明,污水厂的污水处理过程并不能大幅度的减少致病菌的数量。与此同时,剩余污泥最终却是经过重力浓缩池浓缩后直接装船外运,并没有具体的处理方法。可见,绝大多数的致病菌将直接排入环境。 污水厂进水,活性污泥,出水水样中耐四环素乳糖发酵型肠杆菌(TR-LFE)tet基因的出现频率在0%～69.23%之间。总共检测到:tet(A),tet(B),tet(C),tet(D),tet(E),tet(M),tet(G),tet(X)这八种耐药基因,没有检测到核糖体保护蛋白编码的tet(O)和tet(S)基因;乳糖发酵型肠杆菌(LFE)tet基因的出现频率在3.7%～68.18%之间,没有检测到核糖体保护蛋白编码的tet(M),tet(O)和tet(S)基因。 通过对328株耐四环素乳糖发酵型肠杆菌(TR-LFE)和乳糖发酵型肠杆菌(LE)的PCR-RFLP分类,测序得到5种不同菌株,分别为大肠杆菌、志贺氏菌、克雷伯氏菌、气单胞菌和鲍氏不动杆菌,其16S rDNA的同源性分别为100%～99%;并用相应的tet引物对其中的某些菌株进行再次测序,同源性也都在100%～97%之间,可见此前的实验研究是科学严谨并是可信的。 对污水厂活性污泥中耐四环素基因在不同季节和工况下的检测发现,在不同的时间点,tet基因广泛分布在活性污泥中,但是污水厂一系列的处理过程也不能有效减少tet基因的种类。同时,经过对滴水湖生物膜上带有的耐药基因检测对比后证明了污水厂带有的耐药基因远远高于自然界一般地表径流中的含量。 通过实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)对目标基因进行量化,看到闵行污水厂中tet(A)基因浓度要高于tet(C)基因浓度,并且这两种基因浓度要大大高于自然湖体中携带的含量。从中可以看出,也许由于上海甚至是整个中国地区对抗生素药物的使用及排放没有做过多的控制,使得本地区污水中的耐药基因浓度要远远高于其他地区。 最后,对带有tet基因的菌株进行质粒提取后发现,大多数菌株都含有大小及数量不等的质粒条带,质粒的获得率大于93.4%。同时将带有tet(A),tet(B),tet(C)和tet(D)耐药基因的质粒进行测序发现,其结果与致病性肠杆菌具有高度同源性。但仅根据本次实验的研究深度,未能观察到携带质粒的菌株与其耐药性及耐药基因之间有明显关系这需要在后续的研究中进一步的深入。 【关键词】：污水厂 耐四环素乳糖发酵型肠杆菌 耐药基因
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：X172
【目录】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-13
• 第一章 引言13-17
• 一、研究意义13-14
• 二、研究目的与内容14-15
• 三、研究结构流程图15-17
• 第二章 文献回顾17-57
• 引言17
• 一、抗生素进入生态环境的途径17-18
• 二、环境中的抗生素,细菌和耐药性18-20
• (一)、环境中的抗生素18
• (二)、环境中的细菌18-19
• (三)、环境中的抗生素耐药性19-20
• 三、水环境中耐药菌的污染现状20
• 四、水环境中耐药基因传递机制初探20-21
• 五、水环境中耐药菌的主要来源21-22
• (一)、医院和制药厂污水排放21-22
• (二)、城市下水道和污水处理厂22
• 六、水环境中耐药菌的危害研究22-23
• 七、环境中的四环素23-52
• (一)、四环素的发现与发展24-27
• (二)、四环素的耐药性27-52
• 八、水环境中四环素存在情况的国内外研究进程52-54
• 九、总结54-55
• 十、未来方向55-57
• 第三章 污水处理厂活性污泥中耐四环素乳糖发酵型肠杆菌(TR-LFE)的研究57-68
• 简介57
• 一、乳糖发酵型肠杆菌(LFE)简介57-58
• 二、采样点简介58-60
• (一)、上海市闵行区污水处理厂58-60
• (二)、滴水湖60
• (三)、采样点60
• 三、材料60-61
• (一)、药品与试剂60
• (二)、相关仪器60
• (三)、培养基60-61
• 四、方法61
• (一)、细菌培养61
• (二)、培养基配置61
• 五、结果与分析61-68
• (一)、菌落基本形态61-62
• (二)、细菌总数62-63
• (三)、不同工况处理后对TR-LFE和LFE细菌数的影响63-64
• (四)、各季节不同工况处理后对TR-LFE和LFE细菌数的影响64-66
• (五)、本章小结66-68
• 第四章 污水处理厂活性污泥中耐四环素乳糖发酵型肠杆菌(TR-LFE)基因型分析68-88
• 简介68
• 一、材料68-69
• (一)、菌株68
• (二)、药品与试剂68-69
• (三)、相关仪器69
• 二、方法69-72
• (一)、DNA模板制作69
• (二)、PCR反应69-71
• (三)、琼脂糖凝胶电泳71
• (四)、限制性片段长度多态性分析(RFLP)71
• (五)、PCR产物纯化71-72
• (六)、测序鉴定72
• 三、结果与分析72-88
• (一)、耐四环素乳糖发酵型肠杆菌(TR-LFE)基因型统计72-81
• (二)、多重耐药性耐四环素乳糖发酵型肠杆菌(TR-LFE)基因型统计81-82
• (三)、限制性片段长度多态性分类分析82-83
• (四)、测序结果83-86
• (五)、本章小结86-88
• 第五章 耐四环素乳糖发酵型肠杆菌(TR-LFE)质粒DNA对耐药基因的验证88-95
• 简介88
• 一、材料88
• (一)、菌株88
• (二)、药品与试剂88
• (三)、相关仪器88
• (四)、培养基88
• 二、方法88-91
• (一)、细菌培养88
• (二)、抽提质粒88-90
• (三)、琼脂糖凝胶电泳90
• (四)、质粒DNA大小的测定90
• (五)、PCR检测质粒携带的耐药性基因90
• (六)、PCR产物纯化90
• (七)、测序鉴定90-91
• 三、结果与分析91-95
• (一)、质粒抽提结果91
• (二)、PCR验证质粒携带的耐药性基因91-92
• (三)、测序结果92-94
• (四)、本章小结94-95
• 第六章 污水处理厂活性污泥中四环素耐药基因的研究95-102
• 简介95
• 一、材料95-96
• (一)、药品与试剂95-96
• (二)、相关仪器96
• 二、方法96-97
• (一)、活性污泥的DNA提取96-97
• (二)、PCR反应97
• 三、结果与分析97-102
• (一)、不同季节活性污泥中耐药基因的出现情况97-99
• (二)、污水处理过程中耐药基因的出现情况99-100
• (三)、滴水湖耐药基因的相关情况100
• (四)、本章小结100-102
• 第七章 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对四环素耐药基因的量化102-111
• 简介102
• 一、材料102
• (一)、药品与试剂102
• (二)、相关仪器102
• 二.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定方法102-104
• (一)、标准品浓度102-103
• (二)、标准曲线103-104
• (三)、扩增曲线104
• 三.结果与分析104-111
• (一)、闵行污水厂tet(A)和tet(C)基因的量化104-107
• (二)、污水处理过程中tet(A)和tet(C)基因的变化107
• (三)、紫外(UV)消毒前、后的出水样品107-108
• (四)、滴水湖tet(A)和tet(C)基因的量化108-110
• (五)、本章小结110-111
• 第八章 总结和展望111-116
• 一、总结111-114
• 二、展望与建议114-116
• (一)、展望114
• (二)、建议114-116
• 附录116-122
• 附录1 tet基因PCR扩增结果图116-118
• 附录2 闵行污水厂活性污泥PCR扩增结果118-120
• 附录3 闵行污水厂81株TR-LFE菌株质粒提取图谱120-122
• 参考文献122-134
• 致谢134

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