1,1,1-三氯乙烷（TCA）污染地下水及其富集培养物中脱氯细菌的定量与多样性分析

【摘要】：TCA具有致癌性、致畸性,是我国最普遍的有机污染物之一,严重危害人体健康和生态环境,因此对TCA污染治理的研究十分必要。采用顶空-GC-FID法测定了某TCA污染场地的6个地下水样品中的TCA、1,1-二氯乙烷(1,1-dichloroethane,DCA)和氯乙烷(chloroethane,CA)的浓度。所有样品中均测得TCA的生物降解产物DCA和(或)CA,由此推测此6个采样点的地下水中可能存在TCA的生物降解。采用特异性荧光实时定量PCR分别测定6个样品中Dehalobacter的丰度,结果表明,6个样品中Dehalobacter的丰度差异较大,其中以样品W6中Dehalobacter的丰度最高。以细菌16S rRNA基因通用引物27f和Dehalobacter属特异性引物647r为上下游引物,对总菌DNA进行扩增,利用克隆文库技术将所得扩增产物构建了6个样品的Dehalobacter特异性克隆文库,所得序列与GenBank中的代表性的16S rRNA基因参考序列构建了系统发育树。6个克隆文库共获得41条序列,经序列比对发现,与它们最相似的已知分类地位的16S rRNA基因序列全部属于Dehalobacter属。按照99%的相似性为标准,将所有序列划分成7个可操作性分类单元(OTU),其中OTU1(24 sequences)和OTU2(8 sequences)是最优势的两个OTU,共占全部41条序列的78.0%。OTU1和OTU2的序列与已知能降解TCA的Dehalobacter sp.str.TCA1的16S rRNA基因序列相似性达98%;将文库中的3个OTU(OTU3、OTU5、OTU6)在GenBank中进行16S rRNA同源性比对,最高仅为95~96%,表明该场地可能存在一些新的Dehalobacter细菌类型。本研究表明该TCA污染场地地下水中存在Dehalobacter属细菌,其多样性较丰富,可能与TCA生物降解有关。对4个TCA污染的地下水水样W1、W2、W4、W6在实验室条件下的降解做了探索。将原始地下水样品W1、W2、W4、W6转入血清瓶中,加入维生素B12和酵母提取物作为生长因子,在厌氧、25℃、110 r/min震荡、避光条件下培养九周。培养分为两组,一组加入外源混合电子供体“MEAL”(EA组),另一组不加任何外源电子供体(NE组)。运用顶空-GC-FID法测量培养九周后各个样品中氯代烷烃的降解率,发现在上述培养条件下,EA组中各个样品的氯代烷烃的降解率均高于相对应的NE组样品,可见外源电子供体的添加可加速各样品中氯代烷烃的降解。Dehalobacter相对定量PCR分析发现,培养九周后,各个样品中Dehalobacter含量均下降至原始样本的1/20及以下。PCR-DGGE结果显示各个样品在两种培养条件下培养三周、六周、九周后,原始样品中的优势条带均被弱化,EA组和NE组均出现了新的优势条带,培养前后,菌群结构变化较大。生长因子和外源电子供体的加入、温度等培养条件的变化可能是造成此变化的原因。 【关键词】：1 1 1-三氯乙烷 Dehalobacter 16S rRNA基因克隆文库 Real-time qPCR 多样性
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：X523;X172
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 文献综述12-28
• 1.1 氯代烃的污染现状及治理12-15
• 1.1.1 氯代烃的污染现状12
• 1.1.2 氯代烃污染的治理12-15
• 1.2 TCA综述15-19
• 1.2.1 TCA的理化性质及对环境和人体的危害15-16
• 1.2.2 TCA的非生物和生物转化途径16-19
• 1.2.2.1 TCA的非生物转化途径16
• 1.2.2.2 TCA的生物转化16-19
• 1.3 Dehalobacter综述19-25
• 1.3.1 Dehalobacter属的形态19-21
• 1.3.2 Dehalobacter属的系统分类地位21-22
• 1.3.3 Dehalobacter属的重要功能22-24
• 1.3.4 Dehalobacter属的研究方法24-25
• 1.4 研究微生物组成多样性的分子生物学技术25-28
• 1.4.1 实时定量PCR技术25-26
• 1.4.2 克隆文库分析技术26-27
• 1.4.3 变性梯度凝胶电泳技术27-28
• 第二章 TCA污染地下水中DEHALOBACTER的定量分析28-42
• 引言28-29
• 2.1 材料与方法29-36
• 2.1.1 材料29
• 2.1.1.1 样品来源29
• 2.1.1.2 试剂和仪器29
• 2.1.2 方法29-36
• 2.1.2.1 样本氯代烷烃的检测29-30
• 2.1.2.2 样本无机氯离子的检测30
• 2.1.2.3 Dehalobacter特异性扩增30-32
• 2.1.2.4 Dehalobacter相对定量PCR32-36
• 2.2 结果36-40
• 2.2.1 样本氯代烷烃污染和无机氯离子检测结果36
• 2.2.2 Dehalobacter特异性扩增结果36-37
• 2.2.3 Dehalobacter特异性实时定量PCR结果37-40
• 2.3 讨论40-41
• 2.4 本章小结41-42
• 第三章 TCA污染地下水中DEHALOBACTER的多样性分析42-50
• 引言42-43
• 3.1 材料与方法43-44
• 3.1.1 材料43
• 3.1.1.1 样本来源43
• 3.1.1.2 试剂与仪器43
• 3.1.2 方法43-44
• 3.1.2.1 Dehalobacter属克隆文库的建立43-44
• 3.1.2.2 Dehalobacter属文库的多样性分析44
• 3.1.2.3 核酸序列登录号44
• 3.2 结果44-48
• 3.3 讨论48-49
• 3.4 本章小结49-50
• 第四章 TCA在厌氧培养条件下的降解50-63
• 引言50-51
• 4.1 材料与方法51-55
• 4.1.1 材料与试剂51-52
• 4.1.1.1 材料来源51
• 4.1.1.2 仪器与试剂51-52
• 4.1.2 方法52-55
• 4.1.2.1 TCA在实验室特定条件下的降解的探索52-53
• 4.1.2.2 顶空-GC-FID检测氯代烷烃浓度变化53
• 4.1.2.3 实时定量PCR分析Dehalobacter含量53
• 4.1.2.4 PCR-DGGE法监测微生物群落结构的变化53-55
• 4.2 结果55-61
• 4.2.1 氯代烷烃浓度变化检测结果55-56
• 4.2.2 Dehalobacter含量分析结果56-57
• 4.2.3 微生物群落结构的分析结果57-61
• 4.3 讨论61-62
• 4.4 本章小结62-63
• 参考文献63-72
• 附录1 溶液试剂及培养基配方72-74
• 附录2 仪器设备74-75
• 附录3 缩写和全称75-76
• 致谢76-78
• 研究生阶段已发表或录用的论文78

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