大肠杆菌SZ470利用稻草秸秆产乙醇关键问题的研究

【摘要】：随着能源危机越来越紧迫及环境污染越来越严重，寻找可再生、对环境无污染的能源越来越受人们所关注。利用秸秆纤维素为原料来生产燃料酒精是解决能源问题和环境问题的有效途径之一，但由于秸秆预处理之后的水解液的复杂性及有毒物质会影响乙醇的产量。本论文拟以高产乙醇工程菌Escherichia coli SZ470为发酵菌株（ΔpflB,ΔfrdABCD,ΔackA,ΔldhA），对稻草秸秆产乙醇过程中的关键问题：五碳糖与六碳糖同时利用的问题、水解液脱毒问题及发酵方式进行了研究，其结果如下： 采用稀酸和纤维素酶解的方法来提高秸秆的糖化率。得出最佳稀酸预处理条件：在120℃下，用2%的稀硫酸以1：20的固液比处理60min，半纤维素水解率可以达到90%以上；纤维素酶解糖化的最佳条件：底物浓度为2%，纤维素酶用量为1900U/mL，pH5.0，温度为50℃，反应时间为36h，糖化率达到86.24%。 通过同源重组的方法敲除ptsG基因解决E. coli SZ470同时利用五碳糖与六碳糖的问题。结果显示，缺陷菌株在5%混合糖培养基中能同时利用葡萄糖和木糖进行发酵，葡萄糖消耗量是13g/L，消耗速率为0.5g/(L h)，为对照菌株SZ470的一半；木糖消耗量是20g/L，消耗速率为0.64g/(L h)，是SZ470的3.8倍；乙醇的最高产量为15.01g/L，转化率为89.13%，比SZ470提高了14.32%。该结果说明，缺陷菌株可同时利用葡萄糖和木糖发酵生产高产量的乙醇。 利用大孔吸附树脂吸附糠醛来解决水解液脱毒的问题。比较了D101、D001、D113、D201和D301树脂对糠醛的吸附能力，结果显示：D301树脂优于其他树脂。并进一步通过静态吸附与动态吸附研究了D301树脂对糠醛的吸附特性，得出最佳静态吸附条件：温度25℃，pH值为2，脱毒时间9h，糠醛溶液量为200mL；动态吸附条件：在流速为5mL/min，流出液体积200mL时，开始泄漏,泄漏点吸附量为60.8mg/g，糠醛去除率99.6%。利用静态吸附条件用工程菌SZ470来进行发酵产乙醇，结果显示：水解液脱毒后的乙醇产量为12.73g/L，比不脱毒的提高了28.71%。 采取分步糖化发酵法（SHF法）和同步糖化发酵法（SSF法）对E. coli SZ470进行产乙醇同异的研究。结果表明：SSF（乙醇产量10.21g/L）法优于SHF法（乙醇产量8.4g/L），秸秆的乙醇得率为0.204g/gDRS。乙醇体积分数为1.37%。 【关键词】：稻草秸秆 ptsG基因 脱毒 同步糖化发酵 乙醇
【学位授予单位】：湖北工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：TQ223.122
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-11
• 第1章 引言11-26
• 1.1 能源状况11-12
• 1.2 木质纤维素生产燃料酒精的国内外发展概况12-13
• 1.2.1 国外纤维燃料乙醇的发展概况12
• 1.2.2 国内燃料乙醇的发展概况12-13
• 1.3 木质纤维素原料水解生产燃料酒精的概述13-23
• 1.3.1 木质纤维素水解原料及其组成13-18
• 1.3.2 木质纤维素的预处理18-21
• 1.3.3 木质纤维素水解液发酵生产乙醇21-22
• 1.3.4 木质纤维素发酵目前存在的问题22-23
• 1.4 课题研究内容23-26
• 第2章 稻草秸秆的预处理26-42
• 2.1 实验材料26-28
• 2.1.1 稻草秸秆26
• 2.1.2 主要试剂26-27
• 2.1.3 主要溶液27-28
• 2.1.4 实验仪器28
• 2.2 实验方法28-31
• 2.2.1 葡萄糖标准曲线的制作28
• 2.2.2 还原糖总量的测定28-29
• 2.2.3 液相色谱法测残糖的含量29
• 2.2.4 秸秆预处理条件优化29-30
• 2.2.5 影响纤维素酶水解因素的研究30-31
• 2.2.6 纤维素酶酶解稻草秸秆条件优化31
• 2.3 结果与分析31-41
• 2.3.1 葡萄糖标准曲线31-32
• 2.3.2 稀硫酸预处理稻草秸秆条件的确定32-35
• 2.3.3 酶解因素的研究35-41
• 2.4 本章小结41-42
• 第3章 敲除 pts G 基因使 E.coli SZ470 能同时利用五碳糖与六碳糖42-54
• 3.1 实验材料42-45
• 3.1.1 菌株与质粒42
• 3.1.2 PCR 引物的设计42-43
• 3.1.3 主要试剂43-44
• 3.1.4 主要溶液44
• 3.1.5 主要仪器44-45
• 3.1.6 培养基成份45
• 3.2 实验方法45-47
• 3.2.1 PCR 基因片段的制备45
• 3.2.2 Red 重组功能的诱导和感受态细胞的制备45
• 3.2.3 电转化45-46
• 3.2.4 基因敲除菌株的筛选及抗性基因的消除46
• 3.2.5 基因敲除菌株五碳糖摇瓶发酵46
• 3.2.6 发酵产物检测分析46-47
• 3.3 结果与讨论47-52
• 3.3.1 PCR 片段的制备47-48
• 3.3.2 pts G 基因缺陷株的鉴定48-49
• 3.3.3 质粒 pKD46 的消除49
• 3.3.4 敲除菌株的稳定性检测49
• 3.3.5 卡那抗性基因的消除49
• 3.3.6 基因敲除菌株发酵参数测定49-52
• 3.4 本章小结52-54
• 第4章 采用大孔吸附树脂对水解液中糠醛的研究54-65
• 4.1 实验材料54-55
• 4.1.1 主要试剂54
• 4.1.2 主要仪器54-55
• 4.1.3 菌种55
• 4.2 实验方法55-57
• 4.2.1 大孔吸附树脂的预处理55
• 4.2.2 大孔吸附树脂的静态吸附糠醛55-56
• 4.2.3 大孔树脂动态吸附糠醛56
• 4.2.4 稻草秸秆水解液发酵产乙醇56-57
• 4.3 结果与分析57-62
• 4.3.1 吸附树脂筛选57-58
• 4.3.2 D301 大孔树脂静态吸附糠醛实验58-60
• 4.3.3 D301 大孔吸附树脂动态吸附糠醛60-62
• 4.4 工程菌 E.coli SZ470 利用树脂脱毒水解液发酵产乙醇62-64
• 4.4.1 菌体生长曲线62-63
• 4.4.2 还原糖的利用63
• 4.4.3 乙醇产量63-64
• 4.5 本章小结64-65
• 第5章 采用 SHF 法与 SSF 法对 E.coli SZ470 产乙醇异同的研究65-73
• 5.1 实验材料65-67
• 5.1.1 发酵菌种65
• 5.1.2 培养基65
• 5.1.3 秸秆65
• 5.1.4 主要试剂65-66
• 5.1.5 主要仪器66-67
• 5.2 实验方法67-68
• 5.2.1 大肠杆菌的活化67
• 5.2.2 SHF 法发酵生物乙醇67
• 5.2.3 SSF 法发酵生物乙醇67-68
• 5.2.4 液相色谱法测残糖的含量68
• 5.2.5 气相色谱法测乙醇含量68
• 5.3 结果与讨论68-72
• 5.3.1 两种发酵方式乙醇产量的比较68-70
• 5.3.2 SHF 法与 SSF 法的还原糖比较70-72
• 5.4 小结72-73
• 第6章 结论与展望73-77
• 6.1 结论73-74
• 6.2 特色与特点74
• 6.3 对后续研究工作的展望74-77
• 参考文献77-83
• 致谢83-84
• 附录84

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