甲烷氧化菌素的生物合成及抗氧化活性研究

【摘要】： 利用甲基弯菌(Methylosinus trichosporium) IMV 3011合成甲烷氧化菌素(Methanobactin, mb),确立最佳发酵条件,建立了初步的甲烷氧化菌素分离富集方法,并对其抗氧化活性进行研究。 甲烷氧化菌的甲烷单加氧酶(particulate methan monooxygenase, pMMO)能够催化丙烯氧化成环氧丙烷。由于在有铜的存在下,mb会捕获铜并将其带入细胞传递给pMMO,构建其活性中心。采用气相色谱测定甲基弯菌IMV 3011在有无铜培养的条件下pMMO活性的改变,并分析了mb和pMMO活性的关系。 对比3011的生长曲线和相对应的mb积累曲线,确定最佳培养时间为4天。在研究培养基中CuSO4的添加量对细胞生长和分泌mb的影响的实验中,确定在培养基中CuSO4的含量为0.5μmol/L时,mb的产量相对最大。其中,全波长扫描测得mb在280nm处有吸收峰,该波长用于实验中mb的定量及含量比较。 碳源的选择,对比甲烷、甲醇培养3011在细胞形态、细胞生长及mb产量,发现经过甲醇驯化后的细菌形态上基本没有变化,且甲醇作为碳源进行发酵罐培养3011时,细胞的生长及mb的积累均要好于甲烷摇床培养。 采用HP-20大孔吸附树脂的静态吸附法进行mb富集实验。通过单因素实验,确定10mL大孔树脂最佳上样量为500mL,最佳吸附时间为5h,洗脱剂的用量为20mL,大孔树脂最佳解吸时间为1h。采用以上最佳富集条件,经过旋转蒸发,制得mb含量较高的粗品,其最大产量为13mg/L。并绘制mb标准曲线,用以计算发酵液中的mb含量,并测出mb富集的最终得率,约为72.22%。加对CuSO4前后mb粗粉制得的溶液进行HPLC分析,发现其中一个峰在加入CuSO4后变小,该峰可能为mb的色谱峰,其保留时间为31.468min。 对mb抗氧化活性进行研究。首先,通过NBT还原法与SOD试剂盒法的比较,确定采用实验结果比较稳定的试剂盒法测定甲烷氧化菌素SOD活性。对大孔树脂富集前后甲烷氧化菌素的活性比较,发现富集过后的Cu-mb的SOD活性变小。在不同方法获得Cu-mb的SOD活性的比较中,发现在富集前加入CuSO4结合成Cu-mb的效果要好。 采用DPPH法分析mb抗氧化活性,发现Cu-mb具有清除DPPH自由基的能力,而且结果亦显示富集前结合成Cu-mb的效果更好。而mb的自由基抑制率相对较小,不能确定其是否具有具有清除DPPH自由基活性。 对甲烷氧化菌素的食用油脂抗氧化性能评价。结果显示Cu-mb对猪油、豆油这两种油脂具有抗氧化性(PF1),但是相对比较低。而mb的PF值虽然PF1,但近似等于1,故不能确定mb具有活性。 【关键词】：甲烷氧化菌素 分离富集 抗氧化
【学位授予单位】：哈尔滨商业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R151;TQ920.1
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 1 绪论10-15
• 1.1 甲烷氧化菌素概况10-11
• 1.1.1 甲烷氧化菌10
• 1.1.2 甲烷氧化菌素的发现10
• 1.1.3 甲烷氧化菌素结构特性10-11
• 1.2 甲烷氧化菌素的生物活性的研究现状11-13
• 1.2.1 甲烷氧化菌素抗氧化活性11-12
• 1.2.2 甲烷氧化菌素的抗菌性12
• 1.2.3 甲烷氧化菌素的金属螯合性12-13
• 1.3 本课题来源及研究的意义13-14
• 1.3.1 课题来源13
• 1.3.2 甲烷氧化菌素的研究意义13-14
• 1.4 论文的研究内容14-15
• 2 发酵获得甲烷氧化菌素条件研究15-24
• 2.1 引言15
• 2.2 实验仪器与材料15-16
• 2.2.1 实验仪器15
• 2.2.2 实验材料15-16
• 2.3 实验方法16-18
• 2.3.1 甲烷氧化菌的培养条件16
• 2.3.2 甲烷氧化菌的pMMO活性16
• 2.3.3 甲烷氧化菌素含量测定方法16-17
• 2.3.4 甲烷氧化菌的生长曲线与甲烷氧化菌素产量的关系17
• 2.3.5 铜对菌体生长及产甲烷氧化菌素的影响17
• 2.3.6 碳源的选择17-18
• 2.4 结果与分析18-23
• 2.4.1 甲烷氧化菌的pMMO活性18-19
• 2.4.2 甲烷氧化菌素全波长扫描19-20
• 2.4.3 甲烷氧化菌的生长曲线与甲烷氧化菌素产量的关系20-21
• 2.4.4 硫酸铜添加量对产甲烷氧化菌素的影响21-22
• 2.4.5 甲醇发酵罐培养甲烷氧化菌22-23
• 2.5 本章小结23-24
• 3 甲烷氧化菌素的分离富集24-31
• 3.1 引言24
• 3.2 实验仪器与材料24
• 3.2.1 实验仪器24
• 3.2.2 实验材料24
• 3.3 实验部分24-26
• 3.3.1 甲烷氧化菌素的分离富集24-25
• 3.3.2 甲烷氧化菌素富集参数确定25
• 3.3.3 甲烷氧化菌素的HPLC分析25-26
• 3.4 结果与分析26-29
• 3.4.1 大孔树脂富集mb最佳条件26-28
• 3.4.2 大孔吸附树脂制备甲烷氧化菌素粗品干粉28-29
• 3.4.3 甲烷氧化菌素的HPLC分析29
• 3.5 本章小结29-31
• 4 甲烷氧化菌素的抗氧化活性研究31-41
• 4.1 引言31
• 4.2 实验仪器与材料31
• 4.2.1 实验仪器31
• 4.2.2 实验材料31
• 4.3 实验部分31-35
• 4.3.1 甲烷氧化菌素SOD活性研究31-33
• 4.3.2 DPPH法33-34
• 4.3.3 甲烷氧化菌素的食用油脂抗氧化作用34-35
• 4.4 结果与分析35-40
• 4.4.1 甲烷氧化菌素SOD活性研究35-37
• 4.4.2 DPPH法37-38
• 4.4.3 甲烷氧化菌素的食用油脂抗氧化作用38-40
• 4.5 本章小结40-41
• 结论41-42
• 参考文献42-45
• 攻读学位期间发表的学术论文45-46
• 致谢46

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