mcrA基因的克隆及其在分析沼气池产甲烷菌多样性中的应用研究

【摘要】： 产甲烷菌是严格厌氧菌,利用传统微生物学研究方法对其进行研究费时费力,而近代发展起来的现代分子生物学技术,则避免了这些缺点和不足。现代分子生物学技术以其独特的优势在环境微生物的研究中发挥着越来越重要的作用。 本实验改进了沼气池微生物总DNA的提取方法,经过检验,可满足本研究的需要。本研究通过对产甲烷菌特有mcrA基因的RFLP分析、mcrA基因的荧光定量分析以及16S rDNA的DGGE分析等分子生物学方法对农村户用沼气池中的产甲烷菌群落结构和数量进行了研究。首先扩增了沼气池中产甲烷菌甲基辅酶M还原酶α亚基(mcrA)基因片段,建立产甲烷菌mcrA基因文库,对阳性克隆用限制性内切酶PstⅠ进行RFLP分析,酶切后1、2、3、4号沼气池分别得到3、4、4、2种OTU(operational taxonomic unit),从每一类型OTU中选取1-2个单克隆测序后进行系统进化分析。结果表明,农村户用沼气池中存在不同的产甲烷菌类群,1号沼气池中主要有Methanogenium、Methanocorpusculum和Methanosarcina;2号池中有Methanogenium、Methanocorpusculum、Methanobacterium和未培养菌属;3号池中有Methanospirillum、Methanobacterium和未培养菌属;4号池中有Methanogenium和Methanobacterium。 通过Touch-down PCR策略扩增产甲烷菌16S rDNA序列进行DGGE分析,结果表明,正常发酵产气的沼气池中存在不同的产甲烷菌类群,并不同程度的存在优势菌群。几个沼气池中均有甲烷鬃毛菌(Methanosaeta)、甲烷袋状菌属(Methanoculleus)的分布,还存在着一些分类地位不明确的Uncultured euryarchaeote等菌属。DGGE分析与RFLP分析虽然都是扩增产甲烷菌特异的DNA序列,但对两者结果的比较分析方面来看mcrA基因片段似乎更能特异地用来分析产甲烷菌。 本研究运用实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR,qPCR)方法对各沼气池中存在的产甲烷菌的数量进行了研究。设计了扩增产甲烷菌mcrA基因的特异性引物对qMCR-F/qMCR-R,扩增后构建标准质粒并根据标准质粒构建标准曲线,根据标准曲线对沼气池中的产甲烷菌进行绝对定量。结果显示,各沼气池中产甲烷菌数量在105～108个/mL之间。 【关键词】：产甲烷菌 群落多态性 mcrA RFLP DGGE qPCR
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：S216.4;Q93
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-12
• 第一章 引言12-21
• 1.1 研究背景12
• 1.2 研究目的和意义12-13
• 1.2.1 研究目的12-13
• 1.2.2 研究意义13
• 1.3 国内外研究进展13-21
• 第二章 产甲烷菌mcrA 基因的RFLP 分析21-32
• 2.1 实验材料21
• 2.1.1 主要试剂和仪器21
• 2.1.2 样品采集21
• 2.2 实验方法21-25
• 2.2.1 样品微生物总DNA 的提取21-22
• 2.2.2 mcrA 基因的PCR 扩增22
• 2.2.3 PCR 产物的回收和纯化22-23
• 2.2.4 mcrA 克隆文库的构建23-24
• 2.2.5 mcrA 基因的RFLP 分析24-25
• 2.2.6 测序及系统发育分析25
• 2.3 结果25-31
• 2.3.1 样品微生物总DNA 的提取25
• 2.3.2 PCR 扩增25
• 2.3.3 PCR 产物的回收和纯化25-27
• 2.3.4 克隆文库的构建及阳性克隆的筛选鉴定27-28
• 2.3.5 酶切分析28-29
• 2.3.6 测序及系统发育分析29-31
• 2.4 讨论31-32
• 第三章 沼气池中产甲烷菌的DGGE 分析32-40
• 3.1 实验材料32
• 3.1.1 主要试剂和仪器32
• 3.1.2 样品来源32
• 3.2 实验方法32-35
• 3.2.1 样品微生物总DNA 的提取32
• 3.2.2 16S rDNA 的PCR 扩增32-33
• 3.2.3 产甲烷菌 16S rDNA 的 DGGE 分析33-34
• 3.2.4 优势条带的回收及克隆文库的构建34-35
• 3.2.5 系统发育分析35
• 3.3 结果35-39
• 3.3.1 DNA 提取35-36
• 3.3.2 PCR 扩增反应36
• 3.3.3 回收和纯化36
• 3.3.4 DGGE 分析36-38
• 3.3.5 优势条带的回收及克隆文库的构建38
• 3.3.6 测序及系统发育分析38-39
• 3.4 讨论39-40
• 第四章 产甲烷菌mcrA 基因的荧光定量分析40-48
• 4.1 实验材料40
• 4.1.1 样品采集及样品总DNA 的提取40
• 4.1.2 主要试剂和仪器40
• 4.2 实验方法40-43
• 4.2.1 引物设计40-41
• 4.2.2 标准质粒的构建41-42
• 4.2.3 荧光定量PCR 反应条件的优化42
• 4.2.4 荧光定量PCR 扩增曲线的建立42-43
• 4.2.5 标准曲线的建立43
• 4.2.6 熔解曲线分析43
• 4.3 结果与讨论43-48
• 4.3.1 标准质粒的构建43-45
• 4.3.2 扩增曲线的建立45
• 4.3.3 标准曲线的建立45
• 4.3.4 熔解曲线分析45-48
• 第五章 全文结论、工作不足与展望48-50
• 5.1 全文结论48-49
• 5.1.1 沼气池微生物总DNA 的提取48
• 5.1.2 PstⅠ酶切分析48
• 5.1.3 群落多态性的DGGE 分析48
• 5.1.4 RFLP 与DGGE 的比较分析48
• 5.1.5 荧光定量分析48-49
• 5.2 不足与展望49-50
• 5.2.1 mcrA 基因RFLP 分析49
• 5.2.2 荧光定量不足与解决办法49-50
• 参考文献50-56
• 附录56-60
• 致谢60-61
• 作者简历61

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