兼性厌氧纤维素酶产生菌的筛选及在沼气发酵中的应用

【摘要】： 随着社会发展和世界人口不断增长,人类面临越来越严重的环境危机与能源危机,纤维素是地球上最丰富可再生资源,我国每年农作物秸秆除部分还田外,有相当大的部分被废弃、焚烧,造成严重的环境污染。秸秆厌氧发酵生产沼气是利用秸秆中储存的丰富生物质能的简便途径,在秸秆发酵生产沼气过程中接种厌氧纤维素酶产生菌能够提高秸秆利用率和沼气产量、质量。 本论文通过采用刚果红双层平板初筛和厌氧发酵测定酶活复筛,筛选出一株兼性厌氧纤维素酶产生菌,通过紫外线和亚硝酸单独和复合诱变选育高产纤维素酶突变株,通过单因子和正交实验确定菌株最优发酵培养基和发酵产酶条件,并对菌株所产纤维素酶的组分和酶学性质进行了初步研究。对秸秆发酵生产沼气工艺参数进行了初步优化,并将所筛选的纤维单胞菌CR-14和本研究室保藏的产酸菌B2、氨化菌J5单独和复合应用在秸秆发酵沼气生产中。 1.通过双层刚果红平板从牛瘤胃内容物、污水处理厂处理物、荷花池底淤泥分别分离出4株、34株和22株能产生透明圈的菌株,通过厌氧发酵测定酶活复筛出一株酶活较高的兼性厌氧纤维素酶产生菌。根据菌株形态特征、生理生化特征和16SrDNA同源性和系统进化树分析鉴定该菌株属于Celloulonmonas sp.,命名为CR-14。 2.利用紫外线和亚硝酸进行单独和复合诱变共选育出同原始菌株的透明圈直径和菌落直径比大的突变株87株,其中亚硝酸诱变株27株,紫外诱变株42株,复合诱变株18株。通过厌氧管发酵测定酶活复筛,有6株突变株与出发菌株比差异显著,分别为Y-11、UV-17、UV-28、UV-35、UV-Y-9、UV-Y-16,其中复合诱变株UV-Y-9酶活最高为出发菌株的1.81倍,CX酶活为11.3 U,连续传代8次后,遗传性稳定。 3.菌株CR-14最优发酵培养基:秸秆粉1.0%,MgSO4 0.1%,蛋白胨0.3%,豆饼粉0.3%,KH2PO4 0.1%,NaCl 0.08%。菌株CR-14发酵条件研究表明:培养基初始pH值7.0,30℃条件下发酵3 d发酵液酶活最高;在兼性厌氧条件下,通气量对CR-14菌株的产酶影响不显著,在专性厌氧条件下同样的发酵时间发酵液酶活明显低于有氧条件,为250 mL三角瓶装量150 mL发酵液酶活的62.9%;表面活性剂吐温80对菌株CR-14产酶没有影响。 4.菌株CR-14所产纤维素酶中主要组分酶包括C1酶、CX酶和β-葡萄糖苷酶,CX酶酶活最高,而C1酶和β-葡萄糖苷酶酶活较低。在50℃,pH 6.0的条件下酶活最高的,为该酶的最适反应条件。该酶在pH 6.0-7.5条件下稳定,能保留原活力的80%以上,在60℃以上热稳定性极差,60℃条件下保温1h,酶活仅为40℃条件下保温1 h酶活力的13%。因此,该酶应保存在pH 7.0,50℃以下的条件下。Mn2+、Fe2+能显著促进该酶的活力,Zn2+、Cu2+、Ca2+、K+则抑制了该酶的活力。 5.农业废弃物牛粪、秸秆、菌糠中,秸秆的产气潜力最大,秸秆组甲烷含量与牛粪组差异不显著,但明显高于各菌糠实验组的,从产气量和甲烷含量综合考虑,秸秆是一种较好的沼气发酵原料。通过单因子实验确定了秸秆发酵生产沼气最佳有机负荷率为45 g/L,发酵原料的碳氮比为25/1。在沼气发酵过程中单独接种纤维单胞菌CR-14和接种CR-14、产酸菌B2、氨化菌J5协同发酵都能显著提高沼气产量和质量。 【关键词】：兼性厌氧 纤维素酶 纤维单胞菌 沼气发酵
【学位授予单位】：河北工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：TQ925.1
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 第一章 文献综述11-24
• §1-1 纤维素11
• §1-2 废弃秸秆对环境的影响11-12
• §1-3 纤维素的利用现状12-13
• §1-4 纤维素酶的研究现状13-14
• 1-4-1 国外研究概况13
• 1-4-2 国内研究概况13-14
• §1-5 纤维素酶概述14-16
• 1-5-1 纤维素酶的组成14
• 1-5-2 纤维素酶的分子结构14
• 1-5-3 纤维素酶的作用机制14-15
• 1-5-4 纤维素酶的诱导和调控15
• 1-5-5 产纤维素酶微生物的种类15-16
• §1-6 纤维素分解菌的筛选方法16-18
• §1-7 纤维素酶活性的测定18-19
• 1-7-1 总酶活力的测定18
• 1-7-2 单一纤维素酶组分活力的测定18-19
• §1-8 纤维素酶的分离纯化19-20
• §1-9 纤维素酶的应用20-21
• 1-9-1 在食品工业上的应用20
• 1-9-2 饲料工业中的应用20
• 1-9-3 在洗涤剂工业中的应用20-21
• 1-9-4 在纺织工业上的应用21
• 1-9-5 在植物体细胞杂交育种上的应用21
• 1-9-6 在能源工业中的应用21
• §1-10 作物秸秆厌氧消化研究现状21-22
• §1-11 本课题研究的主要内容22-24
• 第二章 纤维素酶产生菌的筛选、鉴定及系统发育分析24-35
• §2-1 材料与仪器24-25
• 2-1-1 材料24
• 2-1-2 试剂24
• 2-1-3 主要仪器24
• 2-1-4 培养基24-25
• §2-2 实验方法25-29
• 2-2-1 兼性厌氧纤维素酶菌株的筛选25-26
• 2-2-2 菌种的鉴定26-29
• §2.3 结果与分析29-34
• 2-3-1 初筛29-30
• 2-3-2 复筛30-31
• 2-3-3 菌株N14 形态特征31
• 2-3-4 N14 菌株生理生化特征31-32
• 2-3-5 扫描电镜32
• 2-3-6 分子鉴定32-34
• §2-4 小结34-35
• 第三章 菌株CR-14 诱变选育及产酶条件的优化35-45
• §3-1 材料与仪器35
• 3-1-1 材料35
• 3-1-2 试剂35
• 3-1-3 主要仪器35
• 3-1-4 培养基35
• §3-2 实验方法35-37
• 3-2-1 菌株CR-14 诱变育种35-36
• 3-2-2 发酵培养基的优化36-37
• 3-2-3 产酶条件的优化37
• §3-3 结果与分析37-44
• 3-3-1 诱变育种37-40
• 3-3-2 发酵培养基的优化40-41
• 3-3-3 产酶条件的优化41-44
• §3-4 小结44-45
• 第四章 酶学性质的初步研究45-49
• §4-1 材料与仪器45
• 4-1-1 菌种45
• 4-1-2 试剂45
• 4-1-3 主要仪器45
• §4-2 实验方法45-46
• 4-2-1 纤维素酶酶系的确定45-46
• 4-2-2 温度对酶活性的影响46
• 4-2-3 酶的热稳定性46
• 4-2-4 pH对酶活性的影响46
• 4-2-5 不同pH条件下酶的稳定性46
• 4-2-6 不同金属离子对酶活性的影响46
• §4-3 结果与分析46-48
• 4-3-1 纤维素酶酶系的确定46
• 4-3-2 温度对酶活性的影响46-47
• 4-3-3 酶的热稳定性47
• 4-3-4 pH对酶活性的影响47
• 4-3-5 不同pH条件下酶的稳定性47-48
• 4-3-6 不同金属离子对酶活性的影响48
• §4-4 小结48-49
• 第五章 秸秆沼气发酵条件的优化及CR-14 对沼气发酵的影响49-59
• §5-1 材料与仪器49-50
• 5-1-1 材料49
• 5-1-2 主要仪器49-50
• §5-2 实验方法50
• 5-2-1 TS、VS的测定50
• 5-2-2 甲烷含量的测定50
• 5-2-3 沼气发酵原料的选择50
• 5-2-4 有机负荷率的选择50
• 5-2-5 碳氮比的选择50
• 5-2-6 CR-14 发酵秸秆生产沼气实验50
• §5-3 结果与分析50-58
• 5-3-1 沼气发酵原料的选择50-52
• 5-3-2 有机负荷率的选择52-54
• 5-3-3 碳氮比的选择54-56
• 5-3-4 CR-14 发酵秸秆生产沼气实验56-58
• §5-4 小结58-59
• 第六章 结论59-60
• 参考文献60-63
• 致谢63-64
• 攻读硕士期间所取得的相关科研成果64

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