基于Rpf污水处理生物反应器中VBNC菌的分离与系统学研究

【摘要】：利用传统的常规培养法从自然界中只能分离到0.01-10%的可培养微生物,绝大部分微生物都处在活的但非可培养(viable but non-culturable, VBNC)状态,这种微生物的细胞仍具有代谢活性,在一定条件的刺激诱导下,能恢复活性进行代谢繁殖,近年来对于VBNC菌的研究也逐渐受到越来越多的重视。本研究为了探明废水生物反应器中VBNC细菌及其主要菌种的组成与系统关系。利用土质滤材构建生物反应器,基于复苏促进因子(resuscitation promoting factor, Rpf)对VBNC细菌的复苏刺激生长作用,采用MPN (most probable number)法及其MPN培养系判断样品中的细菌总数,稀释平板法分离其中复苏可培养化的VBNC菌株,解析16S rRNA基因系统关系,采用PCR-DGGE技术验证Rpf的作用效果及生物反应器中VBNC菌的存在。主要结果如下： 1.印染废水MPN培养系中,处理组MPN值对应的细菌总数为9.3×106cell/g-2.4×108cell/g,大于对照组MPN值对应的细菌总数4.3×106cell/g-9.3×106cell/g,表明添加Rpf后可培养化细菌总数最高从每g样品的7.5×106ce1l/g提高到2.4×108cell/g; Rpf效果值VR为2.2-32,证实了印染废水生物反应器中存在对Rpf敏感、复苏可培养化的VBNC优势菌群；MPN培养系中处理组各稀释段培养液的OD660值大于对照组的OD660值,表明Rpf对部分细菌菌种有生长刺激作用；经16SrRNA基因测序及其系统关系解析,显示印染废水中对Rpf敏感的VBNC优势细菌主要有Gordonia、Staphylococcus、Tepidimonas、Ochrobactrum、Moraxella、 Enhydrobacter和Cupriavidus属近缘的菌种,Rpf对Bacillus、Stenotrophomonas和Lysinibacillus属菌种有生长刺激作用。系统中所分离细菌的16S rRNA基因序列与已知近缘典型菌的相似性为96.6-100%,从系统树上初步判断其中菌株YDWLR2, YDWLR6和YRJ6可能是新菌种。 2.制药废水MPN培养系中,处理组MPN值对应的细菌总数为2.4×107cell/g-2.4×108cell/g,大于对照组MPN值对应的细菌总数1.5×106cell/g-1.1×108cell/g,表明添加Rpf后可培养化细菌总数最高从每g样品的4.3×106cell/g提高到2.4×108cell/g; Rpf效果值VR为2.2-55.8,证实了制药废水生物反应器中存在对Rpf敏感、复苏可培养化的VBNC优势菌群；同时MPN培养系中处理组各稀释段培养液的OD660值均大于对照组的OD660值,表明Rpf对部分细菌有生长刺激作用；经16S rRNA基因测序及其系统关系解析,显示制药废水中对Rpf敏感的VBNC优势细菌主要有Candidimonas, Microbacterium, Gordonia, Xanthobacter, Aminobacter和Leucobacter属近缘的菌种,Rpf对Comamonas, Alcaligenes和Acidovorax属近缘菌种有生长刺激作用。系统中所分离细菌的16S rRNA基因序列与已知近缘典型菌的相似性为96.6-100%,从系统树上初步判断其中菌株ZYM1, ZYM3, ZYZR4和ZYXR1可能是新菌种。 3.以印染废水运行366d所采样构建的MPN系统为样品进行DGGE电泳,在DGGE图谱中,处理组的条带数明显多于对照组的条带数,处理组的Shannon-Weaver指数也明显高于对照组,说明处理组相比较于对照组,处理组中的菌种多样性更高,证明了Rpf能够促进Rpf敏感菌的生长。通过对DGGE优势条带的测序,结合实际分离菌种的分析后,证实了菌株YRJ1和YRJ6是由于Rpf的诱导作用,从VBNC状态恢复到可培养状态,是存在于印染废水生物反应器中的VBNC菌。 本研究利用复苏促进因子Rpf,探明了废水生物反应器中存在对Rpf敏感的VBNC菌种,包括高GC革兰氏阳性(放线菌)、低GC革兰氏阳性以及革兰氏阴性菌。研究结果揭示了印染废水与制药废水生物反应器中存在VBNC状态细菌,将为研究其形成机理、复苏活性化机制以及印染废水与制药废水的深度处理等提供重要的思路与方法。 【关键词】：生物反应器 VBNC菌 Rpf 16S rRNA基因序列系统关系 PCR-DGGE
【学位授予单位】：浙江师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：X703;X172
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 1 文献综述12-20
• 1.1 活的但非可培养(VBNC)状态细菌的研究进展12-14
• 1.1.1 VBNC菌的形成机理12-13
• 1.1.2 VBNC菌的复苏可培养化13
• 1.1.3 VBNC复苏活化菌体的潜在机能及应用13-14
• 1.2 复苏促进因子(Rpf)的研究进展14-17
• 1.2.1 Rpf的作用机理15
• 1.2.2 Rpf类似蛋白研究15-16
• 1.2.3 Rpf的应用16-17
• 1.3 印染废水和制药废水简介17
• 1.4 本实验研究内容及意义17-19
• 1.5 本研究的技术路线19-20
• 2 基于Rpf利用MPN培养系分离废水生物反应器中VBNC状态菌20-61
• 2.1 实验材料与方法20-32
• 2.1.1 污水连续流生物反应器的构建运行20-22
• 2.1.2 试验样品采集及处理22
• 2.1.3 Rpf的制备22
• 2.1.4 主要试剂与仪器22-25
• 2.1.4.1 主要试剂与药品22-24
• 2.1.4.2 主要仪器24-25
• 2.1.5 培养基及其组成25-26
• 2.1.6 实验方法26-32
• 2.1.6.1 MPN法及其培养系26-28
• 2.1.6.2 Rpf效果与VBNC状态菌的判断28
• 2.1.6.3 菌株分离纯化与保存28-30
• 2.1.6.4 分离菌株基因组DNA提取30-31
• 2.1.6.5 分离菌株DNA的PCR扩增与PCR产物纯化31-32
• 2.1.6.6 分离菌株的系统发育关系树构建32
• 2.2 结果与分析32-55
• 2.2.1 MPN培养系中MPN值与样品细菌总数32-34
• 2.2.1.1 印染废水MPN培养系中MPN值与样品细菌总数32-33
• 2.2.1.2 制药废水MPN培养系中MPN值与样品细菌总数33-34
• 2.2.2 Rpf效果值及其培养液OD值的变化34-40
• 2.2.2.1 印染废水实验系中Rpf效果值及其培养液OD值的变化34-37
• 2.2.2.2 制药废水实验系中Rpf效果值及其培养液OD值的变化37-40
• 2.2.3 生物反应器中分离菌种的菌落形态40-42
• 2.2.3.1 印染废水生物反应器中分离菌种的菌落形态40-41
• 2.2.3.2 制药废水生物反应器中分离菌种的菌落形态41-42
• 2.2.4 分离菌株的16S rRNA基因序列同源性与系统树构建42-50
• 2.2.4.1 印染废水生物反应器中分离菌株的16S rRNA基因序列同源性与系统树构建42-46
• 2.2.4.2 制药废水生物反应器中分离菌株的16S rRNA基因序列同源性与系统树构建46-50
• 2.2.5 反应器中的VBNC菌50
• 2.2.5.1 印染废水生物反应器中的VBNC菌50
• 2.2.5.2 制药废水生物反应器中的VBNC菌50
• 2.2.6 疑似新种菌株的16S rRNA基因系统关系解析50-55
• 2.2.6.1 印染废水生物反应器中新种水平菌株的16S rRNA基因系统关系解析50-53
• 2.2.6.2 制药废水生物反应器中新种水平菌株的16S rRNA基因系统关系解析53-55
• 2.3 讨论55-61
• 2.3.1 Rpf的作用效果55-56
• 2.3.2 VBNC菌近缘菌群机能的检索56-61
• 2.3.2.1 高GC革兰氏阳性菌VBNC菌株56-58
• 2.3.2.2 低GC革兰氏阳性菌VBNC菌株58
• 2.3.2.3 革兰氏阴性菌VBNC菌株58-61
• 3 基于分子生物学方法DGGE对于MPN培养系的组成进行解析61-76
• 3.1 实验材料与方法61-66
• 3.1.1 实验材料61-64
• 3.1.1.1 样品来源61
• 3.1.1.2 实验试剂及配置61-63
• 3.1.1.3 主要实验仪器63-64
• 3.1.1.4 实验所用引物64
• 3.1.2 实验方法64-66
• 3.1.2.1 运用Biospin Bacteria Genomic DNA Extraction Kit提取微生物总DNA64-65
• 3.1.2.2 MPN体系中微生物16S rDNA V3区PCR扩增65
• 3.1.2.3 MPN体系微生物PCR产物的变性梯度凝胶电泳65
• 3.1.2.4 DGGE中优势条带的切胶回收测序65-66
• 3.1.2.5 MPN体系中多样性指数分析66
• 3.2 结果与分析66-74
• 3.2.1 MPN培养系中微生物的PCR扩增结果66-67
• 3.2.2 MPN培养系DGGE电泳图谱及其中对照组与处理组菌种多样性比较67-72
• 3.2.3 MPN培养系DGGE图谱中主要优势条带的测序结果72-74
• 3.3 讨论74-76
• 4 结论与展望76-79
• 4.1 结论76-78
• 4.2 展望78-79
• 参考文献79-92
• 致谢92-93
• 攻读学位期间取得的研究成果93-94

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