祁连山冻土区天然气水合物可培养微生物研究及一株新种细菌的鉴定

【摘要】：天然气水合物是一种新的绿色能源，其主要分布在深海沉积物及陆域永久冻土带中。据资料显示，全球的天然气水合物的资源量约为2.1×10~15m~2。由于天然气水合物巨大的能源潜力和环境效应，在20世纪中叶，尤其是在中下叶后世界各国掀起了研究天然气水合物的热潮。2008年9月，我国勘探学家家在青海省祁连山冻土区钻获了天然气水合物实物样品，这一伟大发现使我国成为首个在中低纬度钻获天然气水合物的国家，并且我国成为第四个在冻土区发现水合物的国家。距今为止，全世界对天然气水合物的研究尚浅，尤其是在我国的天然气水合物研究起步较晚，很多技术都落后于他国，国家对此赋予了高度重视。作为世界第三冻土大国，并且有有利地形，我国有潜力发现更多的水合物矿藏。青海高原冻土区天然气水合物的勘探成功引起了国内外的高度重视，这一发现是我国能源领域的又一大突破。然而至今为止，天然气水合物的地质微生物研究主要集中在深海的天燃气水合物富存区沉积物中的微生物研究，在冻土区天然气水合物方面的研究进展很少，仅有一些关于加拿大马更些矿区和美国阿拉斯加山脉的冻土水合物研究，并且其中的微生物研究也很少，目前国内对于这一块的研究也处于空白状态。我们根据海底天然气水合物与微生物结合方面的研究基础，对冻土区天然气水合物微生物研究展开分析，通过对分离培养得到的嗜（耐）冷微生物的分析，以及其他相关菌种的分析研究，摸索其分布规律，目的是建立一套完善的油气微生物勘探技术。由于在祁连山冻土区有广泛的油页岩的存在，所以本课题以祁连山冻土区天然气水合物微生物研究的依托下，对其所在区域的油页岩中的微生物也做了初步的分离，以期能够分离筛选出具有趋油潜力的微生物。在微生物的分离培养过程中，由于岩芯样品采集自很少有人研究的青藏高原，所以分离筛选出了较多了新种微生物，本文仅对其中的一种新种细菌做详细的分析研究。本课题研究的主要内容有： 1.对青海省祁连山冻土区天然气水合物岩芯实物样品的可培养微生物进行分析。通过在不同温度相同pH值的培养条件下，比较4种培养基对冻土区天然气水合物的细菌培养能力，筛选出最优培养方法,并在PYGV培养基的条件上进行了适当的调整。在PYGV培养基上，经过了24周的培养观察统计，DK2钻井岩芯共分离出4738个菌落，分离鉴定出95株细菌，分属于12个属。DK-6岩芯样品中共计数3442个单菌落，分离鉴定出110株细菌，分属于27个属。可培养微生物分离过程中得到4株细菌新种。经过菌种16S rDNA菌种鉴定结果显示DK2和DK6钻孔岩芯分离出的可培养微生物的序列在系统进化树上聚类为两个主要的系统分类群：革兰氏阴性菌群变形杆菌门和革兰氏阳性菌群，其中变形杆菌门(Proteobacteria)，分布于-、β-、γ-和-变形杆菌亚群中；革兰氏阳性菌群包含了高(G+C) mol%的放线菌门(Actinobacteria)、低(G+C)mol%的厚壁菌门(Firmicutes)和CFB菌群的拟杆菌门(Bactemides)以及异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)。通过对岩芯烧失量等环境因素和微生物种类的分析发现，微生物的分布受环境影响非常大，与底层构造有着密切的关系，同时微生物之间也有着共生的关系。微生物和岩芯地质环境共同构成了祁连山冻土区天然气水合物稳定体系。 2.通过对祁连山冻土区油页岩岩芯的微生物分离筛选和微生物实验室已有保藏菌种（克拉玛依油田发酵种子）的培养，共得到了8株具有趋油能力的的高纯度微生物。对此8株微生物又进行了石油培养驯化，其中两株仅能够在石油培养基上生长，其它6株具有显著的聚油效果。对这8株微生物有进行了16S rDNA菌种鉴定，确定了其分类，并建立了菌种的发育关系。 3.对祁连山冻土区天然气水合物可培养微生物分离过程中发现的新种细菌进行新种鉴定，测定了新种微生物的16S rDNA序列，此种微生物属于Hymenobacter属，它与之发育最相近的菌种为H.desert，相似性为96%。实验进一步确认了新种微生物的培养基和最适培养条件，菌种为革兰氏阴性菌，细胞色素氧化酶阳性，过氧化氢酶阳性。又测定了菌种的生理生化指数，细胞成分等。确定此菌种为Hymenobacter属的新种。 【关键词】：天然气水合物 可培养微生物 油页岩 烧失量 16S rDNA
【学位授予单位】：北京化工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：Q93
【目录】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-16
• 第一章 前言16-31
• 1.1 祁连山冻土区天然气水合物微生物16-23
• 1.1.1 冻土区天然气水合物16
• 1.1.2 祁连山冻土区16-17
• 1.1.3 天然气水合物17-18
• 1.1.4 冻土区微生物的研究18-20
• 1.1.5 环境微生物研究进展20-23
• 1.2 祁连山冻土区油页岩中趋油微生物的分离鉴定23-26
• 1.2.1 油页岩中的趋油微生物23-24
• 1.2.2 油页岩的理化性质及功能简介24
• 1.2.3 油页岩的生产利用现状24-25
• 1.2.4 油页岩中有效成分的利用方法25-26
• 1.3 新种鉴定26-29
• 1.3.1 细菌的分类和鉴定方法26-27
• 1.3.2 传统鉴定指标27
• 1.3.3 细胞化学成分鉴定27-28
• 1.3.4 DNA碱基比例(G+C mol%)28-29
• 1.3.5 DNA、RNA相关性研究29
• 1.4 本研究目的和意义29-31
• 第二章 祁连山冻土区天然气水合物可培养细菌的分离培养31-60
• 2.1 材料与方法31-37
• 2.1.1 研究样品概况31-33
• 2.1.2 主要试剂33
• 2.1.3 培养基33-34
• 2.1.4 钻探岩芯样品处理34
• 2.1.5 菌种的分离和培养34-35
• 2.1.6 分离菌种16S rDNA菌种鉴定35-36
• 2.1.7 可培养菌株的多样性计算36-37
• 2.1.8 细菌多样性与钻孔环境响应关系分析37
• 2.2 结果与分析37-59
• 2.2.1 四种培养基上菌落生长情况37-38
• 2.2.2 分离培养得到的细菌计数38-42
• 2.2.3 分离菌种16S rDNA菌种鉴定结果42-51
• 2.2.4 可培养菌株的多样性51-52
• 2.2.5 微生物与环境岩石样品响应关系初步分析52-59
• 2.3 本章小结59-60
• 第三章 油页岩中趋油菌的分离60-84
• 3.1 材料与方法60-64
• 3.1.1 样品研究概况60
• 3.1.2 培养基60
• 3.1.3 主要试剂60
• 3.1.4 菌种筛选分离60-62
• 3.1.5 分离筛选菌种趋油实验62-63
• 3.1.6 分离菌种 16S rDNA 菌种鉴定63-64
• 3.2 结果与分析64-82
• 3.2.1 菌种筛选结果64-75
• 3.2.2 细菌趋油效果75-82
• 3.2.3 菌种测序结果82
• 3.3 本章小结82-84
• 第四章 一株新种细菌鉴定84-89
• 4.1 材料与方法84-86
• 4.1.1 菌种来源84
• 4.1.2 培养基84-85
• 4.1.3 实验方法85-86
• 4.2 结果与分析86-88
• 4.2.1 新种 16S rDNA 测序结果86-87
• 4.2.2 表型描述87
• 4.2.3 理化性质87-88
• 4.3 本章小结88-89
• 第五章 结论89-91
• 5.1 祁连山冻土区天然气水合物可培养细菌的分离培养89
• 5.2 油页岩中趋油菌的分离89-90
• 5.3 一株新种细菌鉴定90-91
• 参考文献91-93
• 附录93-99
• 致谢99-100
• 研究成果及发表的学术论文100-101
• 作者和导师简介101-102
• 硕士研究生学位论文答辩委员会决议书102-103

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