厌氧真菌培养液中特异RCC甲烷菌的发现

【摘要】：瘤胃甲烷产生不仅是反刍动物饲料能量的损失,还是温室气体的重要来源之一。因此,瘤胃甲烷生成引起了广泛的关注。然而,目前仍有大量甲烷菌的产甲烷机制及特性尚未被了解。近年来,通过分子生物学手段,甲烷菌的第七个目"Methanoplasmatales"(在瘤胃中被称为古菌C簇,简称RCC)逐渐被发现。由于这一新的甲烷菌目是瘤胃甲烷菌的优势菌群之一,因此他们可能在瘤胃甲烷生成过程中起着重要的作用,但是目前尚没有纯菌株从瘤胃中获得,它们的产甲烷机制也无从了解。本文结合体外培养和分子生物学手段对共存于厌氧真菌培养液中的RCC甲烷菌进行了研究,初步了解其生理特性,为进一步分离纯化提供基础。试验选用3头装有永久性瘤胃瘘管的海门山羊作为体外发酵时瘤胃微生物接种物来源。发酵设置3个重复,采用Orpin培养基,39℃静置培养,每3~4天传一代。利用DGGE方法,研究甲烷菌在厌氧真菌培养液中的动态变化。结果显示,随着传代的进行甲烷菌多样性逐渐降低,在第62代时仅有两条主要条带存在。切胶测序结果显示,一条代表Methanobrevibactersp.Z8(EF222223,相似性98%),另一条代表RCC甲烷菌(LGM-D02:EF222222)。对第25代厌氧真菌培养液中的甲烷菌进行克隆库构建并测序,发现,66个阳性克隆经酶切后,分为13个OTU。其中64个克隆集中到了12个OTU中,这些克隆均属于甲烷短杆菌。仅有2个克隆归属到第13个OTU(LGMAF04:DQ985540)中,且与Candidatus Methanomethylophilus alvus Mx1201相似性为93%。相似性分析发现LGM-D02与LGM-AF04相似性为100%。为了进一步研究传代频率对RCC甲烷菌在厌氧真菌培养液中富集的影响。本文设置了3个发酵组,分别每3天、5天和7天传一代。在每一代发酵结束时采集发酵液样品并对第2、4、9代样品进行real-time PCR定量分析,结果显示,随着传代的进行,5天组(7.50±2.87%)和7天组(16.14±3.19%)发酵液中的RCC甲烷菌占总古菌的比例逐渐升高,而3天组中的RCC甲烷菌占总古菌的比例逐渐降低(0.01%)(P0.05)。结论:瘤胃中存在一类RCC甲烷菌,它们与厌氧真菌有较紧密的共生关系,可以长期存活于厌氧真菌体外培养液中,且通过调节传代频率可以富集这一类甲烷菌,这为进一步研究RCC甲烷菌的特性提供了基础。 【作者单位】：南京农业大学动物科技学院
【关键词】：RCC甲烷菌 厌氧真菌 共培养
【基金】：国家自然科学基金青年项目(31301999) 中央高校基本科研基金(KJ2013018)
【分类号】：S816.3
【正文快照】： 厌氧真菌培养液中特异RCC甲烷菌的发现@金巍$南京农业大学动物科技学院!南京210095 @成艳芬$南京农业大学动物科技学院!南京210095 @毛胜勇$南京农业大学动物科技学院!南京210095 @朱伟云$南京农业大学动物科技学院!南京210095瘤胃甲烷产生不仅是反刍动物饲料能量的损失

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