低温石油烃降解产甲烷富集物的培养及微生物群落结构分析

【摘要】：本论文选用原油和代表性烷烃-正十六烷烃作为碳源，采用传统的Hungate厌氧操作技术，在15℃低温条件下进行产甲烷富集培养；应用生物地球化学的方法（气相色谱、液相色谱和气质联用仪）监测石油烃的降解与甲烷产生过程；同时采用T-RFLP技术和16S rRNA基因克隆文库技术检测富集培养过程中古菌和细菌的群落结构变化趋势，并结合荧光定量qPCR技术和454高通量测序技术揭示产甲烷条件下厌氧烃降解可能的关键微生物类群；最后采用蛋白质组学技术分析可能参与厌氧烃降解产甲烷过程的相关蛋白。取得主要研究成果如下： （1）发现15℃厌氧烃降解产甲烷富集物既能够降解单一烷烃正十六烷烃（200ul）也能够降解复杂化合物原油（1g），甲烷产量分别达到了2mmol和3.7mmol，正十六烷烃的延滞期比原油降解的延滞期长；经过生物降解原油的正构烷烃色谱图有显著地不同，从单驼峰型转变为双峰了，短链烷烃降解（n23）优于长链烷烃降解（n23）。 （2）发现15℃厌氧烃降解产甲烷富集物中同时存在乙酸营养型产甲烷古菌和氢营养型产甲烷古菌，古菌克隆文库分为4个OTU。其中27%的古菌克隆属于Hydrogenotrophic Methanoculleus，67.5%的古菌克隆与乙酸营养型产甲烷古菌甲烷鬃毛菌属Methanosaeta concilii GP6（T-RF284bp）相似性高达99.9%。随着甲烷的产量累积，T-RF284bp片段的丰度也随之增加，因此，T-RF284bp片段代表的乙酸营养型产甲烷古菌在产甲烷条件下石油烃厌氧生物降解中起着关键的作用。 （3）发现15℃厌氧烃降解产甲烷富集物中的细菌群落主要包括Deltaproteobacteria (65.93%)、Mollicutes (9.29%)、 Bacterodia (2.1%)、 Clostridiales (6.1%), Anaerolineales (6.19%)、Betaproteobateria (1.1%)和Alphaproteobacteria (2.1%)组成。结合T-RFLP和克隆文库统计分析发现细菌T-RFs207bp是正十六烷烃降解产甲烷过程中的核心片段，其中T-RF207bp代表的微生物与Syntrophus sp.AJ133795的相似性为98.7%，结合荧光定量qPCR分析发现，随着甲烷含量的积累，Syntrophaceae拷贝数随之增加，这类微生物可能是正十六烷烃降解转化过程中重要微生物类群。 （4）由于蛋白浓度低等问题，没有鉴定出产甲烷条件下厌氧烃降解过程中的关键蛋白，但是鉴定出与脂肪酸代谢（β氧化）相关的酶：反式-2-烯酰辅酶A还原酶、一氧化碳脱氢酶（CODH)，其中反式-2-烯酰辅酶A还原酶就是β氧化中水合的关键酶，根据厌氧烃降解的代谢途径，它可能通过脂肪酸代谢（β氧化）进行后续的代谢。 【关键词】：低温 石油烃 Syntrophaceae 群落结构 454高通量测序
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：X172
【目录】：

• 摘要7-8
• Abstract8-13
• 第1章 绪论13-23
• 1.1 研究背景13
• 1.2 研究目的和意义13-14
• 1.2.1 低温条件下石油烃厌氧生物降解研究13-14
• 1.2.2 石油烃厌氧生物降解过程中的功能基因和功能蛋白14
• 1.3 国内外研究现状14-23
• 1.3.1 石油烃厌氧生物降解的微生物学研究14-17
• 1.3.2 石油烃厌氧生物降解的机理研究17-19
• 1.3.3 石油烃厌氧生物降解中的功能基因及关键酶19-21
• 1.3.4 蛋白质组学在环境微生物研究中的应用21-23
• 第2章 低温石油烃降解产甲烷富集物的培养及微生物群落结构分析23-44
• 2.1 实验目的23
• 2.2 材料和方法23-29
• 2.2.1 样品来源23
• 2.2.2 仪器和试剂23-24
• 2.2.3 培养基24
• 2.2.4 实验方法24-29
• 2.3 实验结果29-42
• 2.3.1 低温产甲烷条件下厌氧石油烃降解的生物地球化学特征29-31
• 2.3.2 低温条件下石油烃生物降解产甲烷富集物的古菌群落结构31-33
• 2.3.3 低温条件下石油烃生物降解产甲烷富集物的细菌群落结构33-39
• 2.3.4 454 高通量数据分析39-41
• 2.3.5 荧光定量分析 16S rRNA 基因41-42
• 2.4 讨论42-44
• 2.4.1 石油烃厌氧降解产甲烷过程中的重要群落42-43
• 2.4.2 石油烃厌氧降解产甲烷过程中的甲烷产生途径43-44
• 第3章 正十六烷烃厌氧降解产甲烷富集物中相关蛋白分析及鉴定44-65
• 3.1 实验目的及技术路线44-45
• 3.1.1 实验目的44
• 3.1.2 技术路线44-45
• 3.2 材料和方法45-50
• 3.2.1 样品来源45
• 3.2.2 仪器和试剂45
• 3.2.3 实验方法45-48
• 3.2.4 双向电泳分析不同碳源厌氧富集物差异蛋白技术体系的建立48-50
• 3.3 实验结果50-63
• 3.3.1 不同碳源产甲烷条件下厌氧石油烃降解的甲烷含量变化50-52
• 3.3.2 不同碳源产甲烷条件下厌氧石油烃降解的群落结构分析52-56
• 3.3.3 不同碳源产甲烷条件下厌氧石油烃降解富集物细胞脂肪酸分析56-59
• 3.3.4 不同碳源产甲烷条件下厌氧石油烃降解富集物差异蛋白分析59-63
• 3.4 讨论63-65
• 3.4.1 厌氧烃降解产甲烷过程中的相关蛋白63
• 3.4.2 厌氧烃降解产甲烷过程中的相关基因63-65
• 第4章 全文结论、工作不足与展望65-67
• 4.1 全文总结65-66
• 4.1.1 低温产甲烷条件下厌氧微生物的群落结构分析65-66
• 4.1.2 产甲烷条件下厌氧石油烃降解相关蛋白66
• 4.2 工作不足与展望66-67
• 4.2.1 未获得起始烃降解的功能基因66
• 4.2.2 未获得起始烃降解的功能蛋白66
• 4.2.3 蛋白质数据与宏基因组数据的结合分析有待进一步加强66-67
• 参考文献67-74
• 致谢74-76
• 作者简历76

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