滨海河流沉积物中产甲烷分离物的获得及其电化学特征

【摘要】：滨海河流是是海岸带区域重要的组成部分,连接陆地和海洋两大碳库,受到全球气候变化和人类活动的双重影响,滨海河流沉积物中二价铁含量丰富,其中富含铁还原微生物。本研究目的在于从富含铁的环境中获得有电活性的铁还原微生物,研究其与产甲烷菌之间的直接电子传递,为将来应用于沉积物微生物燃料电池进行污染物原位修复打下基础。本论文以界河流域为研究对象,分析不同样点理化性质,选取二价铁含量相对较高的Jh3样点进行铁还原富集培养,通过T-RFLP及构建克隆文库分析Jh3原位及富集样品的微生物群落多样性;采用Hungate厌氧滚管法从Jh3铁还原富集样品中分离获得具有潜在种间直接电子传递的产甲烷分离物,分析其微生物群落多样性,比较铁还原及产甲烷能力。构建微生物燃料电池研究产甲烷分离物S6是否具有电活性,进一步验证其存在的直接电子传递途径,是否具有应用于沉积物燃料电池的潜力;对S6进行厌氧滚管分离纯化,获得产甲烷菌及铁还原菌纯菌。主要研究结论如下:(1)铁还原富集培养过程中Jh3具有较好的铁还原能力,比较Jh3原位样品及富集样品的微生物群落多样性,发现Jh3原位样品细菌群落中含有地杆菌、梭菌等铁还原菌,富集培养后异化铁还原菌地杆菌属(Geobacter)成为优势菌,拟杆菌的丰度显著增加。Jh3古菌群落中的优势菌主要为产甲烷菌,富集培养后以甲烷杆菌属/甲烷球形菌属为主。铁还原富集培养使样品富含铁还原菌及产甲烷菌,为研究产甲烷菌与铁还原菌间的直接电子传递提供了基础。(2)以乙醇为唯一电子供体从铁还原富集培养样品中分离获得了产甲烷分离物(S6)。通过T-RFLP及克隆文库分析微生物群落多样性,发现梭菌(Clostridium spp.,与C.tunisiense同源性最高)和甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)是S6中的优势菌群。同时实验表明,S6与Geobacter metallireducens共培养后铁还原和产甲烷能力未明显增加,因此推测Clostridium spp.可能与G.metallireducens类似,将电子直接传递给产甲烷菌M.barkeri产甲烷。此外,微生物燃料电池电化学分析发现,透析袋包裹电极后阻碍微生物与电极表面直接接触形成生物膜,其电流密度显著降低,并且循环伏安扫描无明显氧化还原峰,表明S6中存在直接电子传递途径,即产甲烷分离物中占优势的革兰氏阳性菌Clostridium spp.和M.barkeri之间可能存在种间直接电子传递。(3)进一步分离纯化产甲烷分离物,获得一株能够同时利用乙酸、甲醇、三甲胺底物的甲烷八叠球菌(M.barkeri),命名为Jh-Ar,其电镜形态为八叠球状的团聚状态,具有较高的产甲烷能力。同时分离到一株能够利用乙酸、乙醇、甲醇和三甲胺生长的梭菌目韦荣球菌科铁还原菌,命名为F9,该菌电镜下形态为长杆状,与Selenomonadaceae str.SB90同源性最高,序列相似度达到98.82%。F9不仅能够还原柠檬酸铁,还具有产电活性。Clostridium不仅能够进行胞外电子传递,还可能与M.barkeri通过种间直接电子传递互营产甲烷。这一发现将以前限定在革兰氏阴性菌介导直接电子传递的认识推广到革兰氏阳性菌。 【关键词】：产甲烷分离物 种间直接电子传递 甲烷八叠球菌 铁还原菌 电活性
【学位授予单位】：中国科学院烟台海岸带研究所
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q93
【目录】：

• 致谢4-6
• 摘要6-8
• Abstract8-17
• 1 引言17-27
• 1.1 滨海河流地学特征及界河现状17-18
• 1.2 产甲烷菌18-19
• 1.2.1 产甲烷菌种类18
• 1.2.2 产甲烷途径18
• 1.2.3 产甲烷菌研究意义18-19
• 1.3 产电微生物19-22
• 1.3.1 产电微生物种类19-20
• 1.3.2 产电微生物胞内及胞外电子传递机制20-21
• 1.3.3 产电微生物在微生物燃料电池中的应用21-22
• 1.4 微生物种间直接电子传递 (DIET)22-24
• 1.4.1 种间直接电子传递的发现22
• 1.4.2 团聚体形成及其机制22-23
• 1.4.3 团聚体的应用23-24
• 1.5 本论文的研究内容、意义和技术路线24-27
• 1.5.1 研究内容24-25
• 1.5.2 研究意义25-26
• 1.5.3 技术路线26-27
• 2 滨海河流沉积物微生物群落特征27-45
• 2.1 实验材料27-30
• 2.1.1 沉积物样品采集27
• 2.1.2 培养基配制27-28
• 2.1.3 所需试剂及仪器28-30
• 2.2 实验方法30-37
• 2.2.1 铁还原富集培养30-31
• 2.2.2 DNA提取及电泳检测31-32
• 2.2.3 T-RFLP分析32-33
• 2.2.4 克隆文库构建33-36
• 2.2.5 理化性质测定36-37
• 2.3 实验结果37-43
• 2.3.1 采样位点及样品理化性质37-38
• 2.3.2 Jh3样品铁还原性38-39
• 2.3.3 Jh3样品原位及富集培养微生物群落多样性39-43
• 2.4 讨论43-44
• 2.5 小结44-45
• 3 滨海河流产甲烷分离物的获得及其电化学特征45-65
• 3.1 实验材料45-48
• 3.1.1 研究对象及来源45
• 3.1.2 培养基配制45-47
• 3.1.3 实验试剂及仪器47-48
• 3.2 实验方法48-53
• 3.2.1 分离纯化48-49
• 3.2.2 富集培养49
• 3.2.3 DNA提取49-50
• 3.2.4 T-RFLP分析50
• 3.2.5 克隆文库构建50
• 3.2.6 高分辨率扫描电镜观察50-51
• 3.2.7 微生物燃料电池MFC的构建及数据分析51-52
• 3.2.8 样品检测52-53
• 3.3 实验结果53-61
• 3.3.1 获得产甲烷分离物S653-54
• 3.3.2 富集培养S6和共培养G-S6的铁还原及产甲烷能力54-56
• 3.3.3 微生物群落多样性56-60
• 3.3.4 产甲烷分离物的电化学特征60-61
• 3.4 讨论61-63
• 3.5 小结63-65
• 4 产甲烷菌及铁还原菌的分离纯化65-79
• 4.1 实验材料65-70
• 4.1.1 样品来源65
• 4.1.2 培养基配制65-70
• 4.1.3 相关仪器70
• 4.2 实验方法70-72
• 4.2.1 分离纯化70-71
• 4.2.2 富集培养71
• 4.2.3 菌种鉴定及分析71-72
• 4.3 实验结果72-78
• 4.3.1 产甲烷菌分离纯化72-75
• 4.3.2 铁还原菌分离纯化75-78
• 4.4 讨论78
• 4.5 小结78-79
• 5 结论与研究展望79-81
• 5.1 本研究的主要结论79
• 5.2 本论文的主要创新点79-80
• 5.3 本论文的存在的不足80
• 5.4 展望80-81
• 参考文献81-91
• 作者简介91-93
• 硕士期间发表论文93

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