秸秆纤维素高效降解菌株的筛选及对秸秆降解效果初步研究

【摘要】： 为了利用纤维素降解菌促进作物秸秆快速腐解还田,解决秸秆资源的农田高效利用、培肥土壤和保护生态环境关键技术问题,进行了秸秆纤维素高效降解菌株筛选和降解效果的研究。取得以下主要结果: 1.筛选了高效降解秸秆纤维素的细菌2株、丝状真菌1株,构建了3组复合菌系。2株纤维素降解细菌50P、42P分别鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus);丝状真菌菌株Y5经鉴定为赭绿青霉(Penicillium ochrochloron);3组复合菌系分别为Y2b、Y54B、36。 2.赭绿青霉菌Y5液体培养第4d时各酶活达到最高;复合菌系Y2b的内切酶和全酶活在第2d时达到最大,3d时外切酶活和β-葡萄糖苷酶活达到最大;复合菌系Y54B第2d时,全酶活与内切酶活达到最大,第3d时外切酶与β-葡萄糖苷酶活达到最大;复合菌系36外切酶活与β-葡萄糖苷酶活较为显著,4d时达到最大,全酶活达到最大时的时间分别是第4d和第5d。 在最佳产酶时间内,赭绿青霉菌Y5与复合菌系Y2b的产酶最适pH=6,复合菌系36和对照菌AS3.3711的最适pH= 5;复合菌系Y54Bd的最适pH=6.5;菌株Y5最适产酶温度为35℃,复合菌系Y2b、Y54B、36的最适产酶温度分别是35℃、40℃和25℃;菌株Y5与复合菌系Y2b、Y54B、36的最适氮源都是硝酸盐,它们最佳用量分别为1.5%、1%、1.5%和1.5%。玉米秸秆为复合菌系36和对照菌AS3.3711最适作用底物,小麦秸秆为菌株Y5以及复合菌系Y2b、Y54B的最适作用底物。复合菌系Y2b属于低温产酶的复合菌系,是本研究的创新点。 3.赭绿青霉菌Y5液体培养10d前后对小麦秸秆纤维素、半纤维素、木质素降解率分别达到了43.5%、49.7%和9.3%。Y2b降解效果显著,在整个培养过程中半纤维素含量共下降了45.9%,纤维素含量共下降了40.2%;复合菌系Y54B、36在10d内降解半纤维素分别为11.2%和10.7%,降解纤维素分别为28.7%,32.6%。3个复合菌系Y2b、Y54B、36的木质素降解量分别为23.6%、22.2%和25.5%。 4.土壤盆钵实验条件下,秸秆纤维素降解菌Y5和复合菌系Y2b具有高效降解秸秆纤维素的能力,对小麦秸秆的降解能力尤强。使用秸秆降解菌和复合菌系,显著提高土壤有机质含量,尤其以菌群Y2b最为显著。施用复合菌系Y2b和菌株Y5的土壤有机质含量都达到2.9%左右。30d实验结束时,使用菌株Y5的秸秆半纤维素、纤维素和木质素含量分别下降了4.6%、14%和6%,接种复合菌系Y2b的秸秆木质素降解较明显,降解率最高达19%。秸秆降解菌Y5和复合菌系Y2b具有良好的应用前景。 5.采用PCR-DGGE技术研究了复合菌系Y2b对土壤微生物多样性影响。结果表明,使用复合菌系Y2b增加了土壤微生物多样性,复合菌系Y2b所包含的菌株具有较好的定殖能力。不同接种处理土壤与秸秆类型对土壤微生物种类和多样性呈现出规律性。经切胶回收克隆测序结果,得到了复合系Y2b的部分优势菌,其中大部分为不可培养菌株。 【关键词】：秸秆纤维素 降解菌 复合系 纤维素酶 土壤接种效果 土壤微生物
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：S141.4
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-13
• 第一章 秸秆纤维素降解菌和秸秆还田研究进展13-24
• 1.1 秸杆纤维素资源与性质13-15
• 1.1.1 秸秆纤维素资源13-14
• 1.1.2 秸秆中纤维素的性质14-15
• 1.2 降解纤维素微生物的研究进展15-16
• 1.2.1 降解纤维素真菌类型16
• 1.2.2 降解纤维素细菌类型16
• 1.2.3 降解纤维素放线菌类型16
• 1.3 纤维素酶的研究进展16-19
• 1.3.1 纤维素降解酶系16-17
• 1.3.2 纤维素酶分子的结构和分类17
• 1.3.3 纤维素酶的催化机理17-18
• 1.3.4 纤维素酶的应用18-19
• 1.4 秸秆还田研究进展19-22
• 1.4.1 我国秸秆还田研究现状与发展趋势19-21
• 1.4.2 国外秸秆还田研究现状与发展趋势21-22
• 1.5 研究的目的和意义22
• 1.5.1 研究目的22
• 1.5.2 研究意义22
• 1.6 研究内容、方法和技术路线22-24
• 1.6.1 研究内容和方法22-23
• 1.6.2 技术路线23-24
• 第二章 秸秆纤维素降解菌的筛选与鉴定24-33
• 2.1 实验材料24-25
• 2.1.1 样品来源24
• 2.1.2 碳源及培养基24-25
• 2.1.3 主要试剂25
• 2.1.4 主要仪器25
• 2.2 实验方法25-27
• 2.2.1 筛选方法25
• 2.2.2 表型特征与生理生化鉴定25
• 2.2.3 细菌16SrDNA、真菌ITS 序列鉴定25-27
• 2.2.4 16S rDNA 系统发育树的构建27
• 2.2.5 ITS 序列系统发育树的构建27
• 2.3 结果与分析27-32
• 2.3.1 纤维素降解菌和复合菌系的筛选27-29
• 2.3.2 分离菌株的降解性质29-30
• 2.3.3 分离菌株的形态学观察30
• 2.3.4 分离细菌 16SrDNA 序列鉴定30
• 2.3.5 基于 16SrDNA 序列的系统发育树的构建30-31
• 2.3.6 细菌的生理生化分析31
• 2.3.7 基于Y5 ITS 序列的系统发育树的构建31-32
• 2.4 结论32-33
• 第三章 秸秆降解菌与复合菌系产酶及其影响因素研究33-44
• 3.1 实验材料33-34
• 3.1.1 药品、试剂和纤维素类物质33
• 3.1.2 实验菌株和培养基33
• 3.1.3 溶液和缓冲液33-34
• 3.1.4 主要仪器34
• 3.2 实验方法34-36
• 3.2.1 纤维素粗酶液的制备34
• 3.2.2 纤维素酶活力的测定34-35
• 3.2.3 葡萄糖标准曲线的测定35
• 3.2.4 培养时间对降解菌株、复合系酶活力的影响35
• 3.2.5 培养液pH 对降解菌株、复合系酶活力的影响35
• 3.2.6 温度对降解菌株、菌群酶活力的影响35
• 3.2.7 氮源对降解菌株、菌群酶活力的影响35-36
• 3.2.8 秸秆纤维素类型对降解菌株酶活力的影响36
• 3.3 结果与分析36-42
• 3.3.1 培养时间对降解菌株酶活力的影响36-39
• 3.3.2 pH 值对降解菌株酶活性的影响39
• 3.3.3 温度对降解菌株作用效果的影响39-40
• 3.3.4 氮源对降解菌株作用效果的影响40-41
• 3.3.5 不同纤维素种类对菌株Y5 酶活性的影响41-42
• 3.4 结论42-44
• 第四章 秸秆降解菌和复合菌系液体培养对小麦秸秆降解效果44-49
• 4.1 实验材料44
• 4.1.1 实验菌株和复合系44
• 4.1.2 秸秆纤维素与培养基44
• 4.1.3 试剂配制44
• 4.2 实验方法44-45
• 4.2.1 秸秆纤维素降解菌群生长曲线的测定44-45
• 4.2.2 小麦秸秆木质纤维素的定量测定45
• 4.2.3 改进的Van Soest 洗涤法（差重法）45
• 4.3 结果与分析45-48
• 4.3.1 纤维素降解菌群的生长曲线45-46
• 4.3.2 培养过程中小麦秸秆内纤维素类物质的变化46-48
• 4.4 结论48-49
• 第五章 复合菌系 Y2b 对秸秆降解和土壤微生物的影响49-64
• 5.1 实验材料49-50
• 5.1.1 供试菌株：复合菌系 Y2b49
• 5.1.2 主要仪器设备49
• 5.1.3 主要的缓冲液和试剂49
• 5.1.4 DNA 提取试剂49-50
• 5.1.5 土壤样品与作物秸秆50
• 5.2 实验设计与方法50-54
• 5.2.1 土壤有机质含量变化测定50-51
• 5.2.2 腐殖质中纤维素、半纤维素和木质素含量测定51
• 5.2.3 微生物群落多样性的分析51-54
• 5.3 实验结果与分析54-63
• 5.3.1 盆钵试验中土壤有机质含量的测定54-57
• 5.3.2 盆钵试验中作物秸秆各成分的测定57-58
• 5.3.3 土壤样品中微生物多样性分析58-63
• 5.4 结论63-64
• 第六章 全文总结64-66
• 参考文献66-73
• 致谢73-74
• 作者简历74

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